• بازدید : 45 views
  • بدون نظر
خرید ودانلود فایل تحقیق بررسي ايمني زايي ژنهاي L7/L12 و P39 در موشهاي Balac است.-دانلود رایگان تحقیق بررسي ايمني زايي ژنهاي L7/L12 و P39 در موشهاي Balac است-خرید اینترنتی تحقیق بررسي ايمني زايي ژنهاي L7/L12 و P39 در موشهاي Balac است-دانلود رایگان مقاله بررسي ايمني زايي ژنهاي L7/L12 و P39 در موشهاي Balac است
این فایل در ۶۲صفحه قابل ویرایش تهیه شده وشامل موارد زیر است:

هدف از اين تحقيق بررسي ايمني زايي ژنهاي L7/L12 و P39 در موشهاي Balac است. بنابراين پس از جداسازي و تكثير ژنهاي فوق مراحل زير در اين تحقيق انجام گرفت. در ادامه برای آشنایی بیشتر شما توضیحات بیشتری می دهیم

ابتدا محيط برنسط برات را تهيه و استريل نموده و ml5 از محيط را با بروسط آبورتوس سويه ۱۹S تلقيح مي نمائيم. پس ۴۸ تا ۷۲ ساعت باكتريها رشد كرده و كدورت مناسبي را پيدا مي كند. بقيه مراحل تخليص كروموزوم بشرح زير است:

۱- ۵/۱ ميلي ليتر از سوسپاستيون فوق را مدت ۲ دقيقه در rpm5000 سانتريفوژ مي نمائيم. محلول رويي را دور مي ريزيم.

۲- Ml576 از بافر TE را بر روي رسوب باكتري اضافه كرده و رسوب را در بافر حل مي نمائيم. سپس ml30 از SDS(10%) و ml3 از پروئيناز K (mg/ml20) را افزوده و بمدت يكساعت در دماي ۰C37 نگهداري مي نمائيم.

۳- پس از مخلوز Ml100 از (M5)NaCl از محلول CTAB/NaCl بميزان Ml80 اضافه كرده و بمدت ۱۰ دققيق در  0C65 انكوبه مي كنيم.

۴- هم حجم مخلوط بالا از تركيب كلروفرم – ايزوآميل (۱/۲۴) به مخلوط افزوده و سپس از مخلوط بمدت ۵ دقيقه در rpm10000 سانترفوژ مي كنيم. محلول رويي را به لوله ديگر منتقل مي نمائيم.

۵- هم حجم محلول روئي ترميب فنل – كلروفرم – ايزوآميل (۱/۲۴/۲۵) پس از مخلوط بمدت ۵ دقيقه در vpr10000 سانتريفوژ كرده و محلول رويي به لوله ديگري منتقل مي نمائيم.

– هم حجم محلول روئي ايزوپروپانل اضافه نموده و مخلوط مي كنيم. پس از چند دقيقه DNA كروموزومي ته نشين شده كه مي توان بات يك پيپت پاستور آنرا جمع آوري نمائيم.

۷- رسوب DNA كروموزومي را با الكل ۷۰% شستشو داده و پس از خشك شدن در مجاورت هوا در Ml100 از بافر TE حل مي نمائيم.

بررسي كمي و كيفي DNA كروموزومي:

براي تعيين خلوط كروموزوم باكتري از مواد و وسايل زير استفاده ميشود


– تائيد ژنوم سنتز شده توسط PCR:

براي تاييد صحت قطعه ژنوم بدست آمده از PCR از هضم آنزيمي ژنهاي فوق استفاده مي گردد. چنانچه از هضم آنزيمي ژن L7/L12 با آنزيمهاي EC0RI و Hind III بترتيب قطعات (۱۶۸+۲۰۶) و (۳۰۵+۶۹) بايد ديده شود و از هضم آنزيمي ژن P39 با آنزيمهاي NEOL و Hind III بترتيب قطعات (۱۳۶+۵۶۰+۷۰۹) و (۵۵۳+۶۵۲) بايد ديده شود.

براي تاييد نهايي صحت ژنهاي تكثير شده از نظر ماهيت و ترادف نوكلئوتيدي آنها، اين ژنها ابتدا در ناقل pSK+ كلون گرديد و سپس براي تعيين سكانس به شركت مربوط ارسال گرديد.

– كلونينگ ژنهاي L7/L12 و P39 در كلونينگ pSK+:

براي كلونينگ ژنهاي فوق ابتدا بايد ژنها تحت اثر آنزيمهاي BamHI و xhoI قرارگرفته، سپس ناقل پلاسميدي pSK نيز با آنزيمهاي اخير برش داده شود.

۱- برش آنزيمي ژنهاي L7/L12 و P39 با آنزيمهاي BamHI و xhoI.

۱-   برش آنزيمي پلاسميد pSK با آنزيمهاي BamHI و xhoI پلاسميد pSK در حدود kb96/2 وزن دارد. اين پلاسميد داراي يك ناحيه تكثيري ColE1، يك ناحيه مقاومت به آمپي سيلين تحريك ناحيه f1 origin و يك ناحيه بنام multiple cloning site=MCS كه جايگاه تعدادي از آنزيمهاي تحديدي را در خود دارد. براي تكثيز پلاسميد فوق از باكتري اشديشياكلي  استفاده مي گردد.

۲-   براي برش آنزيمي اين پلاسميد ابتدا باكتري حاوي اين پلاسميد  را تكثير ميدهد. در ضمن تكثير باكتري پلاسميد مورد نظر در باكتري همانندسازي كرده و تعداد آن افزايش مي يابد. براي تكثير باكتري از كشت آن در ml2 محيط LB حاوي ng/ml50 آنتي بيوتيك آمپي سيلين استفاده مي شود. پس از ۱۸ ساعت كشت مورد نظر كدورت مناسب را پيدا ميكند. پس از آن پلاسميد از باكتري تخليص ميگردد.

ترانسفورماسيون

مواد لازم:

         سلولهاي Competent

         پلاسميد DNA نوتركيبي

         محيط كشت مايع نوترين برات

         پليت حاوي محيط كشت نوترين آگار به همراه آمپي سيلين

         گرمخانه  0C37

روش كار:

۱- سلولهاي Comptent باكتري ) E.coli.(DH5 را از ۰C70- بيرون آورده روي يخ قرار مي دهيم تا باز شود.

۲- مقدار ml10 از مخلوط پلاسميد نوتركيب شده در مرحله قبل، را به سلولهاي Competent مي افزائيم.

۳- نمونه فوق را بمدت ۳۰ دقيقه در يخ قرار ميدهيم.

۴- پس از زمان فوق اپندرف حاوي نمونه را بلافاصله در گرمخانه ۰C37 بمدت ۵ دقيقه قرار ميدهيم.

۵- مجدداً نمونه ها را بمدت ۲ دقيقه در يخ قرار ميدهيم.

۶- مقدار ml800 محيط كشت نوترين برات به نمونه فوق اضافه كرده و بمدت يكساعت در ۰C37 انكوبه مب كنيم.

۷- پس از انكوباسيون، سوسپانسيون فوق را به پليتهاي حاوي نوترين آگار (محتوي Ng/cl60 آمپي سيلين) منتقل كرده و پليتها را ۱۸ ساعت در گرمخانه ۰C37 قرار مي دهيم.

– غربالگري

باكتريهاي رشد يافته پس از ترانسفورماسيون در محييط نوترين برات آنتي بيوتيك كشت داده و پس از حدود ۱۸ ساعت كه كدورت محيط مناسب شد، پلاميت آنها را تخليص مي كنيم. پلاسميدهيا تخليص شده را برروي ژل آگارز ۱% بررسي مي نمائيم. پلاسميدهائي كه حاوي ژن مورد نظر باشند، حركت كنتري دارند لذا از ساير پلاسميدهاي فاقد ژن قابل شناسايي مي باشند. پس از شناسايي اين باكتريها با انجام  PCR و هضم آنزيمي پلاسميد با آنزيمهاي BamHI و xhoI مورد تاييد قرار مي گيرند بطوريكه در PCR قطعه مورد نظر ديده شود و در هضم آنزيمي از پلاسميد خارج شود.

– تعيين ترادف نوكلئوتيدي قطعه مورد نظر:

پس از بدست آوردن كلون مو رد نظر، پلاسميدها را پس از تخليص براي تعيين ترداف نوكلئوتيدي به شركت MWG ارسال نموديم.

– كلون نمودن ژنها در پلاسميد بيان كننده پروكاريوتي:

براي توليد پروتئين نوتركيب از ژنهاي L7/L12 و P39 به سه جزء اصلي نياز است:

۱- ناقل بيان كننده expression vector

۲- قطعه ژن مورد نظر

۳- ميزبان


عتیقه زیرخاکی گنج