• بازدید : 45 views
  • بدون نظر
این فایل در ۴۷صفحه قابل ویرایش تهیه شده وشامل موارد زیر است:

اين محلول ، بافر تريس بازي با غلظت mM 50 ،‌۸/۵=PH مي باشد كه از محلول استوك آن ،‌با غلظت mM200 به طريقة زير تهيه شد:
مقدار g22/24 تريس بازي وزن شد و با ml800 آب مقطر در يك بشر يك ليتري مخلوط شد. PH اين محلول با استفاده از محلول Hcl ،‌۳۷% تا ۸/۵= pH پائين آورده شد. سپس حجم نهايي توسط آب مقطر به يك ليتر رسانده شد. محلول استوك بدست آمده ، ۴ بار رقيق شد تا محلول بافر A حاصل شد.
– محلول بافر B:
اين محلول ، بافر تريس بازي با غلظت mM50 ،‌۸/۶PH= مي باشد كه همانند محلول بافر A تهيه شد با اين تفاوت كه كاهش pH محلول تا ۸/۶=pH  صورت گرفت.
۳-۱- محلول بافر C:
اين محلول ، بافر فسفات سديم با غلظت mM10،۸/۶= pH است كه از محلول استوك آن با غلظت mM 100به طريقه زير تهيه گرديد:
مقدار g81/35 نمك فسفات دي سديك و g6/15 نمك فسفات مونوسديك به همراه ml800 آب مقطر در يك بشر يك ليتري مخلوط شد. سپس pH محلول توسط محلول Hcl، ۳۷% تا ۸/۶= pH پائين آورده شد و با آب مقطر حجم نهايي محلول به يك ليتر رسانده شد. محلول استوك بدست آمده ، ۱۰ بار رقيق شد تا محلول بافر c بدست آمد.
۲- محلولهاي االكتروفورز:
۱-۲- محلول بافر تانك يا الكترود:
اين محلول شامل تريس بازي با غلظت M025/0 و گلايسين با غلظت M192/0 ، با ۳/۸= pH در آزمايشات الكتروفورز بكار گرفته شد. اين محلول به حجم يك ليتر به صورت زير تهيه شد:
مقدار g03/3 تريس بازي و g4/14 گلايسين وزن شده و در يك بشر يك ليتري تا حجم يك ليتر ، آب مقطر به آنها اضافه گرديد.
۲-۲-محلول بافر ژل متراكم كننده (ژل فوقاني):
اين محلول با غلظت M5/0 تريس بازي ، ۸/۶ = pH به طريقة زير تهيه شد:
مقدار g 1/6 تريس بازي به همراه ml70 آب مقطر در يك بشر مخلوط شد و با كمك محلول Hcl37%، pH  آن تا ۸/۶ كاسته گرديد. سپس حجم نهايي محلول با آب مقطر به ml100 رسانده شد.
۳-۲- محلول بافر ژل جدا كننده (ژل تحتاني):
اين محلول با غلظت M5/1 تريس بازي ، ۸/۸ = pH به طريقة زير تهيه شد:
مقدار g 2/18 تريس بازي در ml70آب مقطر به حالت محلول درآورده شد و توسط محلول Hcl37% pH آن تا  8/8 كاهش پيدا كرد. سپس حجم نهايي محلول با آب مقطر به  ml 100 رسانده شد.
۴-۲- محلول بافر نمونه (× ۵):
حجم ml15 محلول بافر تريس بازي با غلظت ۱M، ۸/۶= pH (g81/1 تريس بازي در ml15 آب مقطر) تهيه شد. به اين محلول ml25گليسرول ، و ml10 آب مقطر افزوده گرديد و بخوبي مخلوط شد. به محلول حاصل چند بلور رنگ برموفنل بلو اضافه شد تا محلول به رنگ آبي تيره درآمد.
۵-۲- محلول آكريل آميد – بيس آكريل آميد:
پودر آكريل آميد و بيس آكريل آميد سمي بوده و بايد از استنشاق آنها جلوگيري كرد. جهت تهيه محلول استوك ۸/۳۰% از آن با استفاده از دستكش و ماسك ، در زير هود شيميايي ،‌مقدار g30 پودر آكريل آميد و g8/0 پودر بيس آكريل آميد وزن شد و در يك بشر تا حجم ml100 آب مقطر مخلوط گرديد. براي حل شدن بهتر مواد فوق در آب مقطر ، بشر در حمام آب گرم قرار داده شد و به كمك همزن مغناطيسي به مدت ۳۰ دقيقه مخلوط شد. سپس محلول بدست آمده توسط كاغذ صافي فيلتر شد و در ظرف تيره رنگي در يخچال نگهداري گرديد. محلول فوق خطرناك و نورو توكسيك مي باشد و در طي كار آبا آن بايد از دستكش استفاده كرد.
۶-۲- محلول آمونيوم پرسولفات (APS):
جهت تهية محلول ۱۰ درصد APS، مقدار g1/0 پودر آمونيوم پرسولفات وزن شده و در ۱ml آب مقطر حل گرديد. اين محلول بهتر است تازه تهيه شده و در يخچال نگهداري شود.
۳- محلولهاي رنگاميزي ژل پلي آكريل آميد:
۱-۳- محلول رنگاميزي كوماسي بلو G-250:
حجم ml50 محلول رنگاميزي با مخلوط كردن اجزاء زير تهيه گرديد:
ml15 متانل و ml10 اسيد استيك گلاسيال با ml25آب مقطر مخلوط شد. به محلول حاصل مقدار g2/0-1/0 رنگ كوماسي بلو G-250 اضافه گرديد تا محلول آبي تيره رنگي بدست آمد. اين محلول بعنوان محلول ثبوت پروتئينها نيز عمل مي كند.
۱-۱-۳- محلول رنگبر:
براي زدودن رنگ از ژل ، به حجم بيشتري محلول رنگبر نسبت به محلول رنگاميزي نياز است . حجم ml100از اين محلول براي رنگبري يك ژل كوچك با ضخامت mm75/0 كافي مي باشد. براي تهية آن ml30 متانل و ml20 اسيد استيك با ml50 آب مقطر مخلوط شد و در ظرف درب بسته اي نگهداري گرديد.
۲-۳- محلولهاي رنگاميزي نقره :
اين محلولها شامل چهارمحلول ، به ترتيب جهت رنگاميزي بكار برده شدند. هر يك از محلولهاي رنگاميزي به حجم ml60 تهيه شد كه جهت رنگاميزي يك ژل كوچك با ضخامت mm75/0 كافي مي باشد. تمامي محلولها براي هر بار رنگاميزي ، تازه تهيه شده و پس از استفاده دور ريخته شدند.
۱-۲-۳- معرف ثبوت:
حجم ml60 محلول استوك استن ۵۰% (V/V) (ml30 استن در ml30 آب مقطر) با حجم ml5/1 محلول استوك تري كلرواستيك اسيد (TCA) 50% (V/V) (ml 75/0TCA در ml75/0 آب مقطر ) مخلوط شد. سپس ۲۵ ميكروليتر محلول فرمالدتيد ۳۷% اضافه شد.
۲-۲-۳- محلول پيش تيمار II :
حجم ۱۰۰ ميكروليتر محلول استوك تيوسولفات سديم ۱۰% (W/V) (g 1/0 تيوسولفات سديم خشك در ۱ml  آب مقطر ) با ml60 آب مقطر مخلوط گشت.
 
۳-۲-۳- معرف رنگ:
حجم ml8/0 محلول استوك نيترات نقره ۲۰% (W/V)  (g2/0نيترات نقره خشك در ml1 آب مقطره ) و حجم ml6/0 محلول فرمالدئيد ۳۷% به ml60 آب مقطر اضافه شده و مخلوط گرديد.
۴-۲-۳- معرف ظهور
مقدار g2/1 كربنات سديم وزن شده و در ml60 آب مقطر حل شد. سپس ۲۵ ميكروليتر محلول فرمالائيد ۳۷% و ۲۵ ميكروليتر محلول استوك تيوسولفات سديم ۱۰% (W/V)  (g1/0 تيوسولفات سديم خشك در ml1 آب مقطر) به محلول فوق اضافه و مخلوط گشت.
۴- معرف برادفورد:
جهت تهيه اين معرف كه به منظور سنجش مقدار پروتئين محلول بكار برده شد، به طريقة زير عمل گرديد:
مقدار mg100 رنگ كوماسي بلو G-250 وزن شده و در ml50 اتانل ۹۵%  حل شد. به محلول حاصل ، ml100 ارتوفسفريك اسيد ۸۵% اضافه گرديد. سپس حجم نهايي محلول با افزودن آب مقطر به يك ليتر رسانده شد. محلول بدست آمده با استفاده از كاغذ صافي فيلتر شده و در ظرف درب داري نگهداري شد.

آماده سازيها:
۱- آماده سازي ژل سفادكس G-50:
مقدار g20 ژل سفادكس G-50 خشك وزن شده و در يك ارلن نيم ليتري با ml300 محلول بافر Bمخلوط شد. سپس اين مخلوط به مدت ۵ ساعت در حمام آب گرم) (۹۰c قرار داده شد تا ذرات ژل كاملاً متورم شدند. در اين مرحله ، ژل گرم ، در دو نوبت ۵ دقيقه اي ، به كمك دستگاه پمپ خلاء ،‌دگازشد تا تمامي حبابهاي هوا از داخل ژل خارج گرديد.
۲- آماده سازي ژل سفادكس G-200:
مقدار g10 ژل سفادكس G-200  به همراه ml200 محلول بافر C  در يك ارلن نيم ليتري با ml 300محلول بافر B مخلوط شد. و همانند روش قبل به مدت ۵ ساعت در حمام آب گرم) (۹۰c  قرار داده شد سپس ژل گرم در سه نوبت ۵ دقيقه اي ، توسط دستگاه پمپ خلاء ، دگاز شد تا تمامي حبابهاي هواي موجود در ژل تخليه گرديد.
۳- آماده سازي ژل تعويض يون DE52:
اين ژل بصورت مرطوب موجود بوده و جهت آماده سازي نيازي به حرارت ندارد. متناسب با حجم ستون مورد نظر ،‌مقداري از ژل مرطوب DE52  در يك بشر با گنجايش ml250ريخته شد و با ml200 بافر B مخلوط گرديد. سپس ظرف حاوي ژل به مدت يك شبانه روز ، با يك بار تعويض بافر ،‌در دماي اتاق قرار داده شد تا ژل با محلول بافر به تعادل رسيد.

عتیقه زیرخاکی گنج